一、方案目的
建立抗感冒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
二、方案概述
方法采用薄層色譜法對(duì)處方中黃芩、甘草、桔梗進(jìn)行鑒別；用高效液相色譜法測(cè)定制劑中黃芩苷的含量。采用AichromBond-AQ-C18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水－磷酸(43∶57∶0.2)；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：280nm；進(jìn)樣量：10μL。結(jié)果薄層色譜專屬性強(qiáng)；黃芩苷的線性范圍為0.0496～0.2976μg,r＝0.9997,平均加樣回收率為101.80%,RSD＝1.86%(n＝6)。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,可作為抗感冒顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
三、抗感冒顆粒
抗感冒顆粒處方由金銀花、連翹、黃芩等9味藥材組成。用于風(fēng)熱感冒,發(fā)熱惡風(fēng),鼻塞頭痛,咽喉腫痛。
四、儀器與試藥
LC-10ADVP高效液相色譜儀,SPD-10AVP紫外檢測(cè)器,HW色譜工作站，電子分析天平
黃芩藥材、黃芩苷、甲醇、乙醇等試劑
五、定性鑒別
1 黃芩薄層色譜鑒別
取黃芩苷對(duì)照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。取本品10g,加甲醇30mL,超聲處理30min,濾過,濾液蒸干,殘?jiān)铀?mL,加熱使溶解,趁熱濾過,濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2,搖勻,80℃保溫30min,放冷,離心15min,殘?jiān)蛹状?.5mL使溶解,作為供試品溶液[1]。取除黃芩以外的其它8味藥材按處方比例制得陰性樣品10g,用與供試品溶液相同的方法制得陰性對(duì)照液。
吸取上述3種溶液各10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對(duì)照液無此斑點(diǎn)。
2 甘草薄層色譜鑒別
取甘草對(duì)照藥材5g,加鹽酸1mL及石油醚(60～90℃)25mL,加熱回流1h,濾過,濾液揮干,殘?jiān)邮兔?60～90℃)1mL使溶解,作為對(duì)照藥材溶液[2]。取本品15g,加鹽酸2mL及石油醚(60～90℃)40mL,用與對(duì)照藥材溶液相同的方法制得供試品溶液。取除甘草以外的其它8味藥材按處方比例制得的陰性樣品15g,用與供試品溶液相同的方法制得陰性對(duì)照液。
吸取上述3種溶液各10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以石油醚(60～90℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(10∶20∶7∶0.5)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%的磷鉬酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對(duì)照液無此斑點(diǎn)。
3 桔梗薄層色譜鑒別
取桔梗對(duì)照藥材5g,加7%的硫酸乙醇-水(1∶3)混合液25mL,加熱回流1h,放冷,用三氯甲烷提取2次,每次20mL,合并三氯甲烷液,蒸干,殘?jiān)蛹状?mL使溶解,作為對(duì)照藥材溶液。取本品15g,加7%的硫酸乙醇-水(1∶3)混合液40mL,用與對(duì)照藥材溶液相同的方法制得供試品溶液。取除桔梗以外的其它8味藥材按處方比例制得的陰性樣品15g,用與供試品溶液相同的方法制得陰性對(duì)照液。
吸取上述3種溶液各10μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙醚(1∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),而陰性對(duì)照液無此斑點(diǎn)。
六、含量測(cè)定
本方中黃芩用量較大,且其中含有的黃芩苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,測(cè)定方法簡便,故在含量測(cè)定時(shí)選擇黃芩苷為指標(biāo)。
1色譜條件
AichromBond-AQ-C18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(43∶57∶0.2),流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：280nm；進(jìn)樣量：10μL。
2對(duì)照品溶液的制備
精密稱取在五氧化二磷干燥器中真空干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品,加甲醇制成每1mL含0.496mg的溶液,搖勻,作為母液。從中吸取5mL,用甲醇稀釋至50mL,制成每毫升含0.0496mg黃芩苷溶液,備用。
3供試品溶液的制備
取10個(gè)批號(hào)的抗感冒顆粒,每批取2份,研細(xì),每份各取0.2g,精密稱定,置具塞三角燒瓶中,精密加入甲醇10mL,稱定重量,超聲處理30min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
4系統(tǒng)適應(yīng)性考察
分別精密吸取黃芩苷對(duì)照液和各供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀。理論塔板數(shù)以黃芩苷峰計(jì),不低于2500,此時(shí),黃芩苷峰與其它相鄰峰基線分離,分離度R>1.5,保留時(shí)間約為14min。
5線性關(guān)系的考察
分別精密吸取濃度為0.0496mg/mL黃芩苷對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、6.0mL定容至10mL量瓶中,搖勻,制成4.96、9.92、14.88、19.84、29.76μg/mL的系列溶液。
精密吸取5個(gè)不同濃度的對(duì)照液各10μL,注入液相色譜儀,各進(jìn)2針。以濃度C為橫坐標(biāo),以黃芩苷平均峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程：C＝2×10-4A＋0.7879,r＝0.9997,線性范圍為0.0496～0.2976μg。
6精密度試驗(yàn)
精密吸取濃度為9.92μg/mL對(duì)照品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)得黃芩苷峰面積值RSD＝2.48%。
7穩(wěn)定性試驗(yàn)
精密吸取批號(hào)為050705的第一個(gè)供試液10μL,每間隔2h進(jìn)一針,連續(xù)考察10h,結(jié)果黃芩苷峰面積值的RSD＝2.76%,表明在10h內(nèi)基本穩(wěn)定。
8專屬性試驗(yàn)
在與樣品測(cè)定完全相同的條件下,精密吸取黃芩陰性對(duì)照液10μL,注入液相色譜儀,連續(xù)進(jìn)3針,陰性無干擾。說明在抗感冒顆粒中,黃芩苷的專屬性較強(qiáng)。
9重復(fù)性試驗(yàn)
取同一批號(hào)(050705)樣品0.25g,共6份,精密稱定,按樣品測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定,測(cè)得樣品中指標(biāo)成分黃芩苷的含量,RSD＝2.12%,結(jié)果表明重復(fù)性良好。
10加樣回收率試驗(yàn)
取批號(hào)為050705的抗感冒顆粒0.25g,精密稱定6份,各精密加入濃度為29.76μg/mL的黃芩苷對(duì)照液2.5mL,分別用與“3.3”項(xiàng)下相同的方法制得供試液。并用與“3.11”項(xiàng)下相同的方法測(cè)得樣品中指標(biāo)成分黃芩苷的含量。
11樣品測(cè)定
精密吸取各供試液10μL,注入液相色譜儀,分別進(jìn)2針。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,根據(jù)取樣量和稀釋度,計(jì)算含量。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,儀器的精密度、指標(biāo)成分的穩(wěn)定性、方法的重現(xiàn)性和加樣回收率等均較好,符合定量要求。根據(jù)以上測(cè)定結(jié)果,暫定每1g抗感冒顆粒中含黃芩以黃芩苷(C21H18O11)計(jì),不得少于0.49mg。
七、結(jié)論
上述實(shí)驗(yàn)中,黃芩、甘草、桔梗的鑒別專屬性強(qiáng),重現(xiàn)性好,操作簡便,故正式納入抗感冒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中；而荊芥、板藍(lán)根的鑒別,因陰性有干擾,專屬性不強(qiáng),故未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。
